花生過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒

說(shuō)明書(shū)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

    花生過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒，采用夾心酶聯(lián)免疫法，用于定量檢測(cè)食品中的花生或花生碎粒。試劑盒中含有酶聯(lián)免疫檢測(cè)所需的所有試劑，包括標(biāo)準(zhǔn)品。
試劑盒足夠進(jìn)行96次檢測(cè)（包括標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定）。
定量分析需要使用微孔板酶標(biāo)儀。
樣品處理： 均質(zhì)和提取
檢測(cè)時(shí)間： 樣品制備（以10個(gè)樣品為例）..............約1小時(shí)檢測(cè)過(guò)程（孵育時(shí)間）.........................1.5小時(shí)
檢 測(cè) 限： < 2.5 ppm花生，相當(dāng)于樣品中0.00025 % 花生含量
特異性： 多克隆抗體可特異性檢測(cè)花生蛋白，包括花生過(guò)敏原Ara h1和Ara h2。
燕麥、小麥、大麥、芝麻或大豆提取物不會(huì)干擾該檢測(cè)。
與各豆類(lèi)，如榛果仁、杏仁、核桃、腰果、開(kāi)心果及山核桃等沒(méi)有任何交叉反應(yīng)。
與鷹嘴豆和青碗豆則會(huì)產(chǎn)生輕微的交叉反應(yīng)。
1、用途
   ，采用夾心酶聯(lián)免疫法，用于定量檢測(cè)食品中的花生或花生碎粒。花生可以作為成份之一或外部感染物而存在和出現(xiàn)于未經(jīng)加工的及經(jīng)加熱處理的食品中。
2、概要
   花生營(yíng)養(yǎng)豐富，常被用作食品或飼料的原料。然而，花生卻是zui強(qiáng)過(guò)敏性物質(zhì)。其果粒中高達(dá)25 %的蛋白質(zhì)成分在具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的同時(shí)也具有過(guò)敏性。其總蛋白含量的7 - 10 %由過(guò)敏性蛋白（如花生球蛋白和伴花生球蛋白）組成。強(qiáng)過(guò)敏性人員僅攝入毫克級(jí)別的花生便可引致過(guò)敏反應(yīng)，癥狀輕則僅為過(guò)敏性皮炎，重則因過(guò)敏性休克導(dǎo)致死亡。因?yàn)榛ㄉ^(guò)敏是終身性存在的且無(wú)法*，所以對(duì)此類(lèi)過(guò)敏人員而言，zui重要的便是避免攝入花生。然而對(duì)過(guò)敏病人而言zui麻煩的便是在經(jīng)過(guò)加工食品中往往隱藏著微量或少量的花生。
   為保護(hù)消費(fèi)者免受花生過(guò)敏影響，人們建立了諸如火箭免疫電泳法、快速蛋白液相色譜法及酶聯(lián)免疫吸附法等檢測(cè)方法和體系，來(lái)檢測(cè)樣品中花生的存在及含量，從而增強(qiáng)產(chǎn)品對(duì)花生過(guò)敏者的安全性。
3、檢測(cè)原理
檢測(cè)的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板中包被有針對(duì)花生蛋白的特殊抗體。加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，其中含有的花生蛋白和特殊的抗體結(jié)合形成抗體抗原復(fù)合物。沒(méi)有結(jié)合的部分在洗滌步驟中被除去。隨后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體（酶連接物）。抗體酶連接物和抗體抗原復(fù)合物結(jié)合，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物（“三明治”夾心法）。沒(méi)有結(jié)合的酶連接物在洗滌步驟中被除去。將底物和發(fā)色劑加入孔中。酶連接物將發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450 nm 處測(cè)量。吸光度值與樣品中的花生濃度成正比。
4、試劑盒組份
每一個(gè)盒中的試劑足夠進(jìn)行96個(gè)試驗(yàn)（包括標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定），盒中的組份如下：
1 x 96孔微孔板（12條每條8孔） 包被有花生抗體
5 x 標(biāo)準(zhǔn)品（每瓶1.3 ml）* 0 ppm零標(biāo)準(zhǔn)品，3.3 ppm，10 ppm，30 ppm，90 ppm花生提取物水溶液，即用型
1 x 酶連接物（11.5 ml）........................................................................紅色瓶蓋過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體，即用型 1 x 底物（7 ml）....................................................................................綠色瓶蓋含有過(guò)氧化脲 1 x 發(fā)色劑（7 ml）.................................................................................藍(lán)色瓶蓋含有四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯 1 x 反應(yīng)終止液（14 ml）........................................................................黃色瓶蓋含1 N的硫酸1 x 提取緩沖液（125 ml）......................................................................白色瓶蓋 20倍濃縮液1 x 洗滌緩沖液（100 ml）......................................................................棕色瓶蓋 10倍緩沖液
*） 已考慮了在樣品處理的過(guò)程中產(chǎn)生的稀釋倍數(shù)100。
5、另需的試劑和設(shè)備
5.1. 設(shè)備：
−微孔板酶標(biāo)儀（450 nm）
−離心機(jī) + 離心管
−振蕩器
−水浴鍋
−粉碎機(jī)，研缽，Ultra-Turrax勻漿機(jī)或者均質(zhì)器
−刻度移液管
−可調(diào)式20 μl - 200 μl 和200 - 1000 μl 微量移液器
5.2. 試劑：
−蒸餾水或去離子水
−脫脂奶粉（食品級(jí)）
6、操作者應(yīng)該注意之事項(xiàng)
反應(yīng)終止液含1 N硫酸（R36/38， S2-26）。
7、儲(chǔ)存條件
保存試劑盒于 2 - 8 °C，不要冷凍。
將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封儲(chǔ)存于2 - 8°C條件下。
無(wú)色發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
對(duì)過(guò)了有效期（見(jiàn)試劑盒外標(biāo)簽有效期）的試劑盒不再提供任何質(zhì)量保證。
不能交叉使用不同批號(hào)的盒中試劑。
8、試劑變質(zhì)的跡象
−發(fā)色劑在使用前顏色變藍(lán)
−標(biāo)準(zhǔn)品5的吸光度值小于0.8（E450 nm < 0.8）
9、樣品處理
以往分析的花生殘留必須去除！樣品處理應(yīng)該在充分清潔或新的玻璃器皿中進(jìn)行。
同樣，粉碎機(jī)等設(shè)備必須在每次樣品處理后進(jìn)行清潔，去除花生殘留。
− 5 g樣品小心粉碎，研磨并充分混合
−取其1 g樣品，加入20 ml提取緩沖液（參見(jiàn)10.1.，即用型提取緩沖液的溫度應(yīng)為約60 °C）
−充分混合，在60 °C條件下提取10分鐘，偶爾振蕩。
−離心：10 min / 2500 g / 盡量保持4 °C或過(guò)濾提取液（或?qū)?/span>2 ml提取液收集于一反應(yīng)容器中，在微量離心機(jī)中高速離心10分鐘）
−上清液按比例1:5（1+4）用即用型提取緩沖液（參見(jiàn)10.1.）稀釋?zhuān)ɡ纾?/span>100 μl樣品和400 μl提取緩沖液混合）
−取100 μl稀釋后上清液每孔進(jìn)行檢測(cè)
備注：
一般來(lái)說(shuō)，巧克力中花生是可以檢出的，但是在多數(shù)情況下非常困難（由于花生抗原被遮蓋導(dǎo)致回收率下降）。為避免抗原被遮蓋，建議在提取過(guò)程中加入1 g脫脂奶粉（食品級(jí)）。此方法同樣適用于冰激凌。巧克力樣品在提取前加熱融化（35 - 45 °C）并小心混合。
樣品提取物在2 - 8 °C條件下可保存5天。不用的提取物在-20 °C條件下可保存數(shù)月。
10、檢測(cè)步驟
10.1. 檢測(cè)前的準(zhǔn)備
使用之前將所有試劑回溫至室溫（20 - 25 °C）。
提取緩沖液為20倍濃縮液。在稀釋前在水浴鍋中37 °C條件下充分溶解可能出現(xiàn)的結(jié)晶并混合。然后對(duì)加熱后的濃縮液按比例1:20（1+19）用蒸餾水稀釋?zhuān)ɡ纾?/span>100 ml緩沖液濃縮液 + 1900 ml蒸餾水，或者直接加入蒸餾水至2500 ml）。稀釋后的提取緩沖液在2 - 8 °C條件下可保存約12周。
洗滌緩沖液為10倍濃縮液，在稀釋前如果存在結(jié)晶，應(yīng)在37 °C水浴鍋中加熱*溶解并混合。然后對(duì)加熱后的濃縮液按比例1:10（1+9）用蒸餾水稀釋?zhuān)ɡ纾?/span>100 ml緩沖液濃縮液 + 900 ml蒸餾水）。稀釋后的緩沖液在2 - 8 °C條件下可保存約4周。
10.2. 檢測(cè)操作
仔細(xì)洗板非常重要。避免在操作過(guò)程中微孔出現(xiàn)干燥。
1. 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品檢測(cè)所需數(shù)量的孔條插入微孔板架，記錄下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置。
2. 將100 μl標(biāo)準(zhǔn)品及處理好的樣品溶液加到相應(yīng)的微孔中，在室溫條件下（20 - 25 °C）孵育30分鐘。
3. 倒出孔中的液體，將微孔板架倒置在吸水紙上拍打（每輪拍打3 次）以保證*除去孔中的液體。每孔加入250 μl洗滌緩沖液（參見(jiàn)10.1.）洗滌微孔。上述操作重復(fù)進(jìn)行兩遍。
4. 向每一個(gè)微孔中加入100 μl酶連接物溶液，在室溫條件下（20 - 25 °C）繼續(xù)孵育30分鐘。
5. 倒出孔中的液體，將微孔板架倒置在吸水紙上拍打（每輪拍打3 次）以保證*除去孔中的液體。每孔加入250 μl洗滌緩沖液（參見(jiàn)10.1.）洗滌微孔。上述操作重復(fù)進(jìn)行兩遍。
6. 向每一個(gè)微孔中加入50 μl 底物和50 μl發(fā)色劑，充分混合后在室溫（20 - 25 °C）條件下暗處孵育30 分鐘。
7. 向每一個(gè)微孔中加入100 μl 反應(yīng)終止液，充分混合。在加入反應(yīng)終止液后30 分鐘內(nèi)于450 nm 處測(cè)量吸光度值。
11. 結(jié)果評(píng)估
使用Cubic spline功能進(jìn)行結(jié)果評(píng)估。
花生樣品濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出（參見(jiàn)4. *）標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值已考慮了稀釋倍數(shù)100。
以下是沒(méi)有使用軟件的計(jì)算方法：
標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值和花生濃度mg/kg（ppm）的相互關(guān)系體現(xiàn)在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖中。每個(gè)樣品中的花生濃度mg/kg（ppm）可以通過(guò)校正曲線上的吸光度值直接讀出。
關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線請(qǐng)參看試劑盒中附帶的質(zhì)保證書(shū)。
如果零標(biāo)準(zhǔn)品的E450 nm較高，可認(rèn)為是未充分洗滌或被污染。
如果樣品吸光度值（E450 nm）大于標(biāo)準(zhǔn)品5的吸光度值，應(yīng)繼續(xù)稀釋后再次檢測(cè)，以使稀釋后的檢測(cè)結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)曲線的可讀范圍之內(nèi)。
備注：
此檢測(cè)中使用的花生提取物中含有約10 %的蛋白質(zhì)成分。
陰性檢測(cè)結(jié)果并不能說(shuō)明花生污染濃度低于檢測(cè)下限，同時(shí)樣品中還可能含有花生的其他成分如脂類(lèi)。