這兩種病的感染都跟它們的發(fā)育類似，包含兩個(gè)或兩個(gè)以上的階段。森林腦炎的病毒血癥階段含有3~14天的孵育階段，在此階段的初期（1-8天）會(huì)出現(xiàn)類似流行性感冒的癥狀。在大概一周沒發(fā)熱的間隔后，感染進(jìn)入第二階段，以神經(jīng)系統(tǒng)方面的癥狀強(qiáng)度的改變?yōu)樘卣鳎@種階段可能持續(xù)幾周時(shí)間。

在疾病第二階段的初期，通常可以檢測到抗森林腦炎的IgM抗體。抗體水平在2~6周后達(dá)到峰值。抗體水平要降低到可檢測以下可能需要10個(gè)月時(shí) 間。抗森林腦炎的IgG抗體在IgM抗體出現(xiàn)的同時(shí)或者之后幾天內(nèi)即可檢測到。感染意味著出現(xiàn)通常能維持一生的免疫力。接種疫苗也能預(yù)防疾病。

腦脊髓液中的森林腦炎特異性抗體可能是在對(duì)森林腦炎抗原進(jìn)行免疫應(yīng)答時(shí)或者之前由血腦屏障的功能紊亂引起的，又或者是局部的免疫應(yīng)答引起的。所以，腦脊髓液中抗體水平的波動(dòng)可能跟這些一般在血清或血漿中的抗體水平不一樣。

由于添加了RF/IgG吸附劑所以RF因子和特異性IgG不會(huì)干涉IgM的檢測。這兩種檢測系統(tǒng)的結(jié)合可以用于森林腦炎疫苗接種后的體液免疫隨訪或者感染，早期的森林腦炎感染和監(jiān)測人血清、血漿和腦脊髓液中的抗體水平。

【檢測原理】

本試劑盒使用的是兩步法ELISA。微孔中包被了失活的森林腦炎病毒。稀釋后的血清、血漿或者腦脊髓液樣本在微孔中孵育。孵育期間，森林腦炎特異性抗體會(huì)跟森林腦炎病毒相集合，未結(jié)合的部分通過洗板洗去。加入酶聯(lián)物進(jìn)行孵育，HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體會(huì)跟人IgG抗體特異性結(jié)合。加入底物液后顏色轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，孵育一段時(shí)間后加入終止液終止反應(yīng)，顏色從藍(lán)色轉(zhuǎn)換成黃色，zui后在酶標(biāo)儀上讀數(shù)。

【儲(chǔ)存和穩(wěn)定性】

此試劑盒在室溫發(fā)貨，儲(chǔ)存在2 – 8℃。避免高溫或太陽光直射。樣本和準(zhǔn)備好的試劑的儲(chǔ)存和穩(wěn)定性在相應(yīng)的章節(jié)都有闡明。包被板條在有效期內(nèi)都能保持穩(wěn)定，儲(chǔ)存在2 – 8℃下時(shí)應(yīng)和干燥劑一起密封在小袋中。

【樣本采集和儲(chǔ)存】

血清、血漿或者腦脊髓液

遵守靜脈穿刺的一般規(guī)定，從收集到實(shí)驗(yàn)期間，保存樣本化學(xué)性質(zhì)的完整是非常重要的，

注意不要使用溶血的、脂血、黃疸的樣本，樣本出現(xiàn)渾濁應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)前離心并去除所有的微粒物質(zhì)。

儲(chǔ)存

2~8℃

≤-20℃（小瓶分裝）

避免高溫和陽光直射，避免反復(fù)凍融

穩(wěn)定性

12個(gè)月

【試劑組成】

數(shù)量	標(biāo)識(shí)	組分
1×12×8	MTP	包被板即用，可拆分，包被了已滅活的TBE病毒
2×75mL	DILBUF	稀釋緩沖液即用，紅色
1×0.6mL	ENZCONJ CONC	酶聯(lián)物藍(lán)色，酶標(biāo)記的抗人IgG抗體
5×0.35mL	CAL 1-5	濃縮校準(zhǔn)品含人血清，穩(wěn)定劑，防腐劑濃縮的倍數(shù)以不同的批號(hào)而不同，具體請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽
2×0.35mL	Control LL Control HL	質(zhì)控LL+HL 濃縮陽性質(zhì)控血清，LL“低水平”HL“高水平” 含：人血清，穩(wěn)定劑，防腐劑。濃縮的倍數(shù)以不同的批號(hào)而不同，具體請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽
1×100mL	WASHBUF CONC	洗滌液，10倍濃縮含磷酸鹽緩沖液
2×12mL	TMB SUBS	TMB底物液即用，含TMB
1×12mL	TMB STOP	TMB終止液即用，含0.5M 硫酸
2×	FOIL	封板片

【試驗(yàn)需要但試劑盒不提供的設(shè)備】

1. 一次性使用的5;25;50;100;500μl加樣槍頭

2. 漩渦混勻器

3. 樣品稀釋管

4. 軌道振蕩器（200-900rpm）

5. 8道微量移液器和加樣槽。

6. 洗瓶，自動(dòng)化或半自動(dòng)化的洗板機(jī)

7. 450nm的酶標(biāo)儀

8. 雙蒸水或去離子水

9. 紙巾，移液管，計(jì)時(shí)器

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】

1. 濃縮試劑的準(zhǔn)備（用于32孔的例子）

稀釋/溶解

組分

加入稀釋液的量

稀釋液

比例

附注

儲(chǔ)存

穩(wěn)定性

80μL

ENZCONJ CONC

8mL

DILBUF

1:101

仔細(xì)混勻

18-25℃

1小時(shí)

10mL

WASHBUF

CONC

90mL

蒸餾水

1:10

仔細(xì)混勻

2-8℃

2個(gè)月

2. 標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣本的稀釋

	稀釋方法	稀釋液	稀釋比例	備注
CAL 1-5 Control LL Control HL	常規(guī)稀釋	DILBUF	1：101	例子：10μL 校準(zhǔn)品/質(zhì)控品+1000μL
血清、血漿	常規(guī)稀釋	DILBUF	1:101	例子：10μL樣本+1000μL
腦脊髓液	常規(guī)稀釋	DILBUF	1:9	例子：50μL樣本+400μL

用于標(biāo)準(zhǔn)曲線方法需要1~5校準(zhǔn)品和指控血清；樣本所含的濃度如果高于zui高校準(zhǔn)品濃度需要進(jìn)一步稀釋。用于一點(diǎn)標(biāo)定法則只需要校準(zhǔn)品4和質(zhì)控血清即可。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

1. 將200μL已稀釋的校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣本加到相應(yīng)的微孔中。

2. 用封板片封板，室溫下（18-25℃）孵育1小時(shí)

3. 揭去封板片，棄去反應(yīng)液，用稀釋后的洗滌液洗板3次（250μL/孔/次），zui后通過拍板拍去殘留的液體

4. 將200μL已稀釋的酶聯(lián)物加到每個(gè)孔中

5. 用封板片封板，在室溫下（18-25℃）孵育1小時(shí)

6. 重復(fù)步驟3

7. 將200μL TMB底物液加到每個(gè)孔中

8. 室溫（18-25℃）孵育30分鐘

9. 按加TMB底物液的順序，將50μL的終止液加到每個(gè)孔中，輕輕混勻

10. 在加入終止液后10分鐘內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450nm±10nm處讀數(shù)。

【結(jié)果的計(jì)算】

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線方法

在半對(duì)數(shù)紙上（或者使用自動(dòng)化儀器）以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為Y軸，相應(yīng)的濃度為X軸做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，推薦使用4參數(shù)邏輯函數(shù)（Y=d+（a-b）/（1+（x/c）^b））。

樣本的濃度應(yīng)當(dāng)直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀取，如果有稀釋，則在計(jì)算中應(yīng)該乘以稀釋倍數(shù)，如果樣本的濃度過高，則需要按照實(shí)驗(yàn)前設(shè)置說明稀釋樣本。

2. 一點(diǎn)標(biāo)定法

（1）樣本濃度的手冊(cè)檢測

需要使用用校準(zhǔn)品4、質(zhì)控血清和樣本各自的平均OD值。校準(zhǔn)品4的OD必須要在的范圍內(nèi)（見一點(diǎn)標(biāo)定法評(píng)估表）。每次檢測都必須計(jì)算檢測特殊的校正因子。校準(zhǔn)品4的理論OD值都是按特定批次檢測得出的（見一點(diǎn)標(biāo)定法評(píng)估表）。將質(zhì)控血清和樣本的OD乘以校正因子：

質(zhì)控血清和樣本濃度可以從批次參考曲線中讀出。

例子：

校準(zhǔn)品4的理論OD值 OD=1.377

校準(zhǔn)品4的檢測OD值 OD=1.273

校正因子F F=1.082

樣本的檢測OD值 OD=0.937

樣本的校正OD值 OD=1.014

讀取濃度 0.5VIEU/mL

（2）腦脊髓液樣本濃度的計(jì)算（一點(diǎn)標(biāo)定法軟件）

打開名為“One Point Calibration TBE IgG Liquor”的Excel文件，將QC證書的下列指標(biāo)填到Excel中：

校準(zhǔn)品4的理論OD值

校準(zhǔn)品4的OD范圍

臨界1和臨界2的理論OD值

臨界1 OD=灰區(qū)的zui低點(diǎn)

臨界2 OD=灰區(qū)的zui高點(diǎn)

填入檢測到的校準(zhǔn)品4平均OD，將腦脊髓液樣本的鑒別和OD插入到已準(zhǔn)備好的計(jì)算單中。腦脊髓液樣本的求值和OD都會(huì)自動(dòng)完成。

【結(jié)果的判定】

血清/血漿

＜63VIEU/mL 陰性

63-126VIEU/mL 灰區(qū)

＞126VIEU/mL 陽性

腦脊髓液

OD＜臨界1理論OD 陰性

臨界1理論OD＜OD＜臨界2理論OD 灰區(qū)

OD＞臨界2理論OD 陽性

【結(jié)果的說明】

1. 疫苗

通過檢測血清血漿中的抗TBE的IgG抗體來證明血清轉(zhuǎn)化

（1）抗TBE IgG陰性

接種疫苗后無血清轉(zhuǎn)化

（2）抗TBE IgG 灰區(qū)

可能有血清轉(zhuǎn)化，建議在2~4周內(nèi)再次檢測

（3）抗TBE IgG陽性

接種疫苗后有血清轉(zhuǎn)化

2. 感染

（1）抗TBE IgM和抗TBE IgG 陰性

無感染

（2）抗TBE IgM陰性和TBE IgG 陽性

這可能是潛在的免疫或者是幾周或幾月之前的感染

（3）抗TBE IgM陽性和TBE IgG陰性

可能有新近感染

（4）抗TBE IgM和抗TBE IgG都陽性

有感染

本譯文由廣州健侖生物科技有限公司技術(shù)人員編譯，僅供參考，詳情請(qǐng)與我們。

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