大腸桿菌檢測試劑盒（熒光PCR法）
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- 產品描述
大腸桿菌檢測試劑盒（熒光PCR法）
說 明 書
【產品名稱】
通用名稱：大腸桿菌檢測試劑盒（熒光PCR法）
【貨號】
BD-Ⅰ-210
【包裝規格】
50Tests/kit
【預期用途】
本品主要用于大腸桿菌檢測鑒定及突發公共衛生事件的處置，還可用于大腸桿菌的環境監測、衛生檢疫及感染的輔助診斷。僅供研究、不用于臨床診斷！
【檢測原理】
本試劑盒采用聚合酶鏈式擴增(PCR)及TaqMan熒光探針技術，對大腸桿菌特異性核酸序列進行擴增并檢測，從而判斷大腸桿菌的存在。
【試劑盒組成】
序號 | 組分 | 數量 | 規格 |
1 | qPCR Master Mix | 1 | 625μl/管 |
2 | 大腸桿菌反應液 | 1 | 375μl/管 |
3 | 大腸桿菌陽性對照 | 1 | 50μl/管 |
4 | RNase Free H2O(陰性對照) | 1 | 100μl/管 |
【儲存條件及有效期】
-20℃避光貯存，避免反復凍融。有效期12個月（請于有效期內使用）。
【適用儀器】
ABI PRISM®7900、ABI PRISM®7500、ABI PRISM®7300、ABI PRISM®7700、ABI PRISM®7000、MJ Opticon 、BIORAD iCycler 、Roch LightCyclerTM、Qiagen Rotor Gene等。
【樣本要求】
樣本采集后應及時檢測，否則應-20℃保存，避免反復凍融，使用干冰或液氮運輸。
【檢驗方法】
1.試劑準備（試劑準備區）
反應液組份 | 加量 (μl) |
qPCR Master Mix | 12.5 |
大腸桿菌反應液 | 7.5 |
待測標本DNA | 5 |
總體積 | 25 |
2.樣本處理（樣本處理區）
2.1取200μl的待檢樣本及陰性對照樣本進行核酸提取。DNA可采用Trizol法、硅膠膜吸附法、磁珠法等微量DNA提取試劑盒提取，按相應說明書要求進行操作。提取好的DNA應及時用于檢測，否則應 - 20℃保存。
2.2加樣：在準備好試劑的PCR反應管中分別加入陰、陽性質控品、待測樣本DNA各5μl，蓋緊管蓋后，瞬時低速離心。
3.PCR擴增檢測（擴增區）
待檢PCR管轉移至擴增區，按順序置于PCR儀上，編輯樣本信息，設定循環參數（請參照各類儀器的操作說明進行設置）。
步驟 | 溫度（℃） | 時間 | 循環數（次） | |
1 | 預變性 | 95 | 5分鐘 | 1 |
2 | 變性 | 95 | 10秒 | 40 |
退火、延伸及檢測熒光 | 58 | 45秒 | ||
步驟2中58℃時熒光檢測，檢測通道：FAM | ||||
*注：ABI系列熒光PCR儀不選ROX校正，淬滅基團選擇None。
4.結果分析
ABI7500熒光PCR儀:將 baseline設為3-15(根據實際情況，baseline cycler可在一定范圍內變化),熒光閾值（threshold）設定原則以閾值線剛好超過陰性對照品擴增曲線（無規則的噪音線）的zui高點，且Ct值=40（或顯示為undet）。使用儀器配套軟件自動分析結果。
5.質量控制
試劑盒中提供陽性質控品、陰性對照各一個，對應Ct值分別為Ct陽、Ct陰；如試劑質量完好并操作正確，Ct陽< Ct陰，Ct陽<30，并呈現典型的S型擴增曲線，否則實驗無效，應檢查儀器、試劑、擴增條件等方面的誤差。在每次檢測中應設置陰陽性對照品。
6．實驗結果的判定
在實驗有效的前提下
Ct值≥38 （或undet） | 陰性結果 |
|
35≤Ct值<38 | 檢測灰區，應重復測定兩次 | 重復測定兩次，Ct值≥38，陰性結果；其中1次Ct值<38 ，陽性結果,FAM通道陽性判斷為感染大腸桿菌 |
Ct值<35 | 陽性結果,FAM通道陽性判斷為感染大腸桿菌 | |
【實驗結果的解釋】
- 在所有對照都滿足要求的前提下，在35個循環之前，所有的臨床樣本的反應擴增曲線都應該超過閾值線，這表明擴增到足夠量的DNA，也表明了樣本質量合格。然而，可能有些樣本會由于初始臨床樣本中的病毒數量較少而無法出現陽性結果。
- 在38個循環之內，陰性質控品和試劑空白（NTC）熒光增長曲線不應該超過閾值線。如果任何其中任何一個的增長曲線超過了閾值線，（1）可能DNA提取試劑污染，在實驗前應確保DNA提取試劑無誤。（2）DNA提取過程或建立反應加樣過程發生交叉污染。應嚴格遵照操作程序的要求進行重復實驗。
- 在30個循環之前，陽性質控品應出現陽性結果。如果沒產生預期的陽性結果則視為無效，應嚴格遵照操作程序進行重復實驗。
【參考值范圍】
1.Ct值≥38（或顯示為undet），陰性結果
2.Ct值<35，陽性結果
【檢測方法的局限性】
1.樣本在收集、處理、運輸以及保存不當時，可能出現假陰性或假陽性結果。
2.如果反應中存在抑制物和過量的DNA模板時也可能出現假陰性。
3.實驗操作的任何失誤都有可能導致無意義的檢測結果。
【產品的性能指標】
本試劑盒能檢測出相當于103copies/ml的大腸桿菌 DNA；與非大腸桿菌無交叉反應。
【試劑盒使用注意事項】
本試劑盒為體外檢測試劑。操作人員應經過專業培訓并具有一定經驗。
為保證實驗結果的準確性和可靠性請使用已校準的移液器，選用進口一次性使用的PCR反應管、離心管、tip頭等進行樣本處理及配液等操作，所有用具應不含DNA酶和RNA酶。
實驗應嚴格分區操作；各區物品,工作服均為,不得交叉使用。實驗后應及時清潔工作臺以防污染。
本產品使用前應在室溫充分融化，混勻并瞬時低速離心。
標本處理應在生物安全柜中進行，以保護操作人員安全和防止對環境的污染。
每次實驗應設置陰陽性對照品。不同批號的試劑請勿混用，在有效期內使用試劑盒。
實驗樣品盡可能新鮮，提取過程應嚴防DNA酶污染及操作不當導致的DNA降解。
在-20℃保存的DNA樣本，加樣前應在室溫充分融化、混勻并瞬時低速離心后使用。
分裝有反應液的反應管應扣蓋或裝入密實袋內再轉移至樣本處理區。
加樣時應使樣品*落入反應液中，不應有樣品粘附于管壁上，加樣后應盡快蓋緊管蓋。
反應液分裝時盡量避免產生氣泡，上機前注意檢查各反應管是否蓋緊，以免物質泄露污染儀器。
擴增完畢取出反應管，密封在塑料袋內，丟棄于地點。
實驗中用過的吸頭請直接打入盛有10%次氯酸鈉的廢物缸內，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
工作臺及各種實驗用物品經常用10%次氯酸鈉、75%酒精和紫外燈進行消毒。
實時熒光PCR儀器使用前預熱30分鐘，連續進行實驗時，儀器間隔一小時以上再使用。
實時熒光PCR儀需經常校正和清潔載樣板板孔。
本試劑盒涉及的檢測樣本應視為具有傳染性物質，操作和處理均需符合衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通用準則》和《醫療廢物管理條例》相關要求。
本司還提供以下試劑盒
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【公司名稱】 廣州健侖生物科技有限公司
【】 楊永漢
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【騰訊 】 2042552662
【公司地址】 廣州清華科技園創新基地番禺石樓鎮創啟路63號二期2幢101-103室
