本測試盒用直接競爭免疫分析法定量測定河豚魚中的河豚毒素（TTX）。該測試盒反應孔可拆卸，可測單份樣品，也可測多份樣品。定量分析時需有含450nm波長的微孔板酶標儀。

1 概要

河豚魚是近海底棲居的肉食性有毒海產魚類，其內臟有毒。其毒性物質主要是河豚毒素，河豚毒素是一種劇烈的神經毒素，其性質穩定，加熱、鹽腌及高溫烹煮均不能使其破壞，其毒性比晴化鈉大1000倍。因誤食或食用加工不當的河豚魚而發生人畜中毒的事件每年都有發生。故準確檢測河豚魚中的河豚毒素對預防和控制河豚毒素中毒，具有重要意義。本檢測方法具有靈敏、快速、簡便、特異性好、取樣量小、不破壞魚體結構，并可同時檢測大量樣品等優點。

2 測定原理

本測試盒利用固相酶聯免疫吸附原理，采用直接競爭ELISA法進行測定。用抗原包被微孔板，加入河豚毒素標準品或樣品、抗河豚毒素酶標單克隆抗體進行免疫反應后，加入底物顯色，終止液終止后，用酶標儀在450nm處測定OD值。

3 提供的物品

微孔板

5個濃度的TTX標準溶液（各1mL）

標準1：0ng/mL    …………………………………………………………直接使用

標準2：5.0ng/mL ……………………………………………………………直接使用

標準3：20.0ng/mL       …………………………………………………直接使用

標準4：50.0ng/mL       …………………………………………………直接使用

標準5：200.0ng/mL     …………………………………………………直接使用

抗TTX抗體溶液（6mL）       …………………………………………………直接使用

顯色液（12mL）       ……………………………………………………………直接使用

終止液（6mL） ………………………………………………………………………直接使用

濃縮洗液（30mL）   …………………………………………………………………稀釋使用

4 盒中未提供，需自備物品

微孔板酶標儀（含450nm）、振蕩器、粉碎機、微量移液器

量筒、漏斗、容量瓶、快速定性濾紙

乙酸、甲醇（分析純）、去離子水或蒸餾水

5 操作者注意事項

    標準溶液中含有TTX毒素，應特別小心。

終止液為1N硫酸，避免接觸皮膚。

每次加樣后立即將所有試劑放回2~8 ℃。

每步加樣時間應控制在5min內。

孵育過程中應避光。

不要使用過期試劑盒。

    不要交叉使用不同批號的試劑盒中的試劑。

6 儲存條件

     保存試劑盒于2~8℃。不要冷凍

     顯色液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

     將不用的微孔板放進原鋁箔袋中，置2~8℃保存。

7 試劑變質的標志

      標準1的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm<0.5）時，表示試劑可能變質。

8 樣品處理

----樣品應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存；

----稱取5g河豚魚樣品（肌肉、皮或內臟），剪碎，組織勻漿器打碎，加入25mL 0.1%的乙酸，在電爐上煮沸攪拌10min。

----待冷卻至室溫后，3000rpm離心10min。

----上清用快速定性濾紙過濾于125mL分液漏斗中。

----沉淀加入20mL0.1% 乙酸，再煮沸3min，重復步驟3~4。

----加入等體積乙迷脫脂，靜置分層，放出水層至另一分液漏斗中，再重復脫脂1次。

----將水層放入50mL量筒中，用0.1%乙酸定容至40mL，4℃保存備用。

----測定時取1mL提取液，用1mol/L氫氧化鈉調節pH至6.5-7.0，立即用于檢測。

9 酶免疫分析程序

----濃縮洗液為10倍濃縮液，使用時與去離子水或蒸餾水按體積比1:9稀釋后使用。

    ----取所需數量的板條插入微孔架，記錄樣品及標準的位置。

    ----加入50mL標準品或處理好的樣品到微孔，每個標準和樣品必須使用新的吸頭。

----加入50mL抗TTX抗體溶液到每個微孔（注意移液器管尖不要接觸到孔中的液體，避免交叉污染）中，37℃孵育90min。

----甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，zui后一次應在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

    ----每孔加入顯色液100mL（2滴），37℃孵育10min。

    ----每孔加入終止液50mL（1滴），立即用酶標儀在波長450nm處測定吸光度值（OD值）。

10 樣品濃度計算

以標準溶液OD值與標準1OD值的比值為縱坐標，所對應標準溶液濃度（ng/mL）的對數值為橫坐標，制作校正曲線。根據樣品OD值與標準1OD的比值，可從曲線上得到對應點的橫坐標，即為TTX濃度的對數值，求得反對數即為測定液中TTX濃度C（ng/mL），按下列公式計算出樣品中TTX含量：

TTX含量（mg/kg）= C×K

式中：C：稀釋后樣品提取液中TTX含量（ng/mL）

            K：樣品稀釋倍數（本提取方法為8）

11 主要技術指標及參數

11.1 zui低檢出濃度5.0 ng/mL。

11.2 加標回收率在70-120%，條內變異系數＜10%，條件變異系數＜15%。

11.3 線性范圍：5.0~200.0ng/ml。

附圖（僅供參考）

                  TTX濃度（ng/mL）對數值

                              TTX校正曲線

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